本文介绍了使用染料结合法（DBL）来检测谷类作物种子中赖氨酸含量的原理、实验流程以及实验注意事项，欢迎收藏。关于茚三酮显色法可以参考《谷类作物种子中赖氨酸含量的测定-茚三酮显色法》

一、原理：

     谷物蛋白中都含有一-定数量的碱性氨基酸,如Ang、His.Lys的碱性基团分别是8一胍基、β~咪唑基及ε-氨基,在pH2~3的缓冲液中,这些碱性基团均带正电荷，当在此溶液中加人一定或过量的偶氦染料(如酸性橙-12),此染料以阴离子存在子溶液中,并与带正电荷的碱性基团作用，定量地生成不溶解的结合物。但由于染料与这三种碱性氨基酸均能结合,为此,可在样品中加入微量的丙酸酐,使其在一定条件下(pH 2~3)与赖氨酸的ε-氨基起特异的酰化作用,日的是掩蔽氨基酸中的E一氨基,防止它与染料结合。同时,另取一份样品,不经酰化处理,并加入数量相同的染料。平衡后测定染料的结合量(DBL),根据两次测定染料结合的差值，即可求得赖氨酸的含量。此法适用于大批分析样品的快速筛选。其化学反应式如下。

氨基酸酰化作用的反应式

赖氨酸与染料（酸性橙-12）结合的反应式

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

    不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎,过100目筛子,收集过筛后的细粉,放入户口瓶内,加人沸程60~90C的石油醚,使其淹过粉面,浸泡8h,不时搅动进行脱脂。然后过滤,并用石油醚淋洗沉淀若于次,弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在千净的滤纸上,置阴京通风处吹于石油醚。收集干粉，置干燥器内,保存备用。

(二)仪器设备

    微型粉碎机(筛孔直径为0.05 cm),分析天平,索氏振荡器,GXD-201型蛋白质分析仪,离心机及离心管,容量瓶移液管,漓定管及管架、加样器、烧杯等。

(三)试剂

1. 磷酸缓冲液:3.40g KH,PO,和20.00g草酸( H2C2O4• 2H2O)分别溶于水中,定量地转入1000mL,容量瓶中。然后再加入1.7mL.85%H3PO4、60mL冰醋酸和1mL丙酸,用蒸馏水定容至刻度。
2. 染料溶液:准确称取1.363g酸性橙-12(Acidorange-12,相对分子质量为350.37)用磷酸缓冲液溶解并定容至1000mL。此溶液的浓度是3.89mmol/L,或每毫升含染料1.363mg。(由于染料的来源不同.它的纯度也不同,故须对染料的纯度进行校正)。
3. 半饱和醋酸钠溶液:取263gNaAc•3H2O溶液后定容至1000mL。pH为3.5左右。
4. 丙酸酐。

三、实验步骤

1.标准回归方程的制作

    （1）用滴定管取出1.363 mg/mL染料液分别为5mL、8mL、10mL、12mL、15mL、20ml、30mL、40m1、50mL至9个50mL容量瓶中,用磷酸缓冲液定容至刻度。用蛋白质分析仪分别测出每一溶液的透光度(T),然后换算成吸光度。以吸光度y和染料溶液浓度x,求测y随x而变的回归方程。
※注:因染料的颜色较深,测定时不灵敏,为此，叮将1.363mg/nL.染料40mL加水25mL,让其透光率为0;以40mL1.363mg/mL染料加水125mL,调其透光度为87%,然后再测定各标准溶液求其T值,再换算成吸光度。

2.样品的测定

    （1）粉碎
    将待测的各种谷物种子10g置微型粉碎机中分别粉碎(粉碎机转速为8000r/min)约 0.5 min,回收全部样品,充分混匀样品,并在80C烘箱中烘2h左右,然后放至于燥器中冷却。

    （2）称重
    称取样品两份,其中一份为酰化样品，称重为300mg;另一份为未酰化的样品,称重为250mg,分别倒至两个离心管中。

    （3）反应
    ●在酰化样品管中加入1mL半饱和醋酸钠溶液及0.1mL丙酸酐。
    ●在未酰化样品管中加入1mL半饱和酷酸钠溶液及0.1mL磷酸缓冲液。
    ●各管摇匀后，加塞,在搅拌器或振荡器上搅拌15min.使之充分酰化,然后分别用快速加样器准确加入10mL1.363mg/mL的染科液,塞紧塞子后，在振荡机(水平式)上振荡1h,反应后的混合液立即以3000-3500r/min离心8-12min。

    （4）测定
将各管离心后的上清液用GXD-201型蛋白质分析仪测定透光度T值。

四、结果计算

(一)单位样品结合的染料量

    根据所测定剩余染料的透光度换算成吸光度后,由标准回归方程算出酰化管中和未酰化管中剩余染料的浓度,再根据下列公式计算出单位样品结合的染料量。

     式中:C为加入染料溶液的浓度,mg/mL,即1.363mg/mL;V为加入染料的体积,10mL; Vc为染料浓度为1.363mg/mL时的体积;CA、CB分别为酰化样品和未酰化样品与染料作用后剩余的染料浓度,mg/mL;WA、WB分别为酰化管和未酰化管中样品的重量;DA与DB分别为酰化和未酰化样品的染料结合量(即单位重量样品结合的染料量);1.1为加人醋酸钠与丙酸酐的毫升数(或醋酸钠和磷酸缓冲液的毫升数)之和。

(二)赖氨酸含量的计算

    根据单位重量样品结合的染料量,计算出未酰化管和酰化管的差值,然后再计算赖氨酸的百分含量。

    式中：350.37为染料的相对分子质量，146.2为赖氨酸的相对分子质量。