糜蛋白酶活性检测试剂盒-糜蛋白酶试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4485 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4484 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 100 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 10 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

-20℃保存

试剂三

液体 5 mL×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前溶于 1.6 mL 甲醇中,再用水定容至 10 mL。可分装后-20℃保存,避免反复冻融。

产品说明:

糜蛋白酶,又称胰凝乳蛋白酶,是胰腺分泌的一种蛋白水解酶,能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似,但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化,对脓性和非脓性痰液均有效;也用于创伤或手术后伤口愈合,如白内障摘除。

糜蛋白酶催化 BTEE 水解,产物在 256nm 有特征光吸收;通过测定 256nm 光吸收增加速率,来计算糜蛋白酶活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/ 96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清即粗酶液。

2. 血清(浆):直接检测。

二、测定步骤

1 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至256nm,蒸馏水调零。

2 试剂一置于25℃水浴中保温30min。

3 样本测定:

试剂名称(μL

测定管

试剂一

90

试剂二

90

试剂三

20

样本

20

将上述试剂分别加入微量石英比色皿/96 UV 板后充分混匀,于 256nm 处测定初始吸光值 A1 3min 时的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

三、糜蛋白酶活性计算公式

A 按微量石英比色皿计算:

1、按样本蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃每毫克蛋白每分钟水解 1μmol BTEE 为一个酶活单位。糜蛋白酶活(U/mg prot)=(ΔA×V 反总÷ε÷d) ÷(Cpr×V 样)÷T=3.8×ΔA÷Cpr

2 按样本质量计算

活性单位定义:25℃每克样本每分钟水解 1μmol BTEE 为一个酶活单位。糜蛋白酶活(U/g 质量)= (ΔA×V 反总÷ε÷d) ÷(W×V 样÷V 提取)÷T=3.8×ΔA÷W

3 按血清(浆)体积计算

活性单位定义:25℃每毫升血清(浆)每分钟水解 1μmol BTEE 为一个酶活单位。糜蛋白酶活(U/mL )=(ΔA×V 反总÷ε÷d)÷V 样÷T=3.8×ΔA

V 样:加入反应体系中粗酶液体积,0.02mL;Cpr:粗酶液蛋白浓度,mg/mL,需要另外测定;W:样本质量,g;V反总:反应总体积,0.22mL;V 提取:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,3min;ε:BTEE 消光系数, 0.964mL/μmol/cm;d:比色皿光径,1cm。

B、按 96 UV 板计算:

将上述计算公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm(96 孔板光径)进行计算即可。

注意事项:

1.  ΔA 大于 0.15 或者吸光值大于 1 时,建议将样本用提取液稀释后测定,注意计算公式中乘以稀释倍数。

2.  ΔA 小于 0.04 时,建议将样本浓缩或者增加样本体积进行测定,注意计算公式除以浓缩倍数或者改变体积。


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