木质素过氧化物酶(Lip)活性检测试剂盒-木质素过氧化物酶(Lip)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4258 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4257 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

试剂一

液体 115mL×1

2-8℃保存

试剂二

液体 5mL×1

2-8℃保存

试剂三

液体 3mL×1

2-8℃保存

产品说明:

木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)(Lip)是一种含亚铁血红素的过氧化物酶,是木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。Lip 在饲料资源开发以及废水、废物处理领域有着广阔的应用前景。藜芦醇可以被 Lip 催化发生氧化反应,其产物藜芦醛在 310nm 处有*大吸收峰,以藜芦醇为反应底物,通过测定 310nm 处藜芦醛的吸光值,可以判定 Lip 的酶活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声波细胞破碎仪、研钵/匀浆器、微量玻璃比色皿/96 孔(UV 板)、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织:按照样本质量(g):试剂一体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)加入试剂一,冰浴匀浆;10000g 4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2、细菌或细胞样本:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL) 500~1000:1  的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL  试剂一)加入试剂一,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 300W,超声 3s,间隔 7s,总时间 3min),10000g 4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

3、培养液或其他液体:直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。

二、测定步骤

1、紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 310nm,蒸馏水调零。

2、测定前根据实验用量取出部分试剂一、试剂二、试剂三置于 37℃预热 10min 以上。若一次性测定样本过多, 可根据使用量将试剂一、二、三按 6:2:1 比例配成工作液后进行预热,测定时按照 20μL 样本+180μL 工作液加入微量玻璃比色皿/96 孔(UV 板)进行测定。

3、加样表(在微量玻璃比色皿/96 孔(UV 板)中依次加入下列试剂):

试剂名称(μL

测定管

试剂一(μL

120

试剂二(μL

40

样本(μL

20

试剂三(μL

20

将上述试剂分别加入微量玻璃比色皿/96 孔(UV 板)后迅速吹打混匀,从加完*后一个试剂开始计时,记录第 15s 的吸光值 A1,将混合液置于 37℃水浴锅/恒温培养箱培养 5min(培养箱有控温功能的可以将温度调至37℃),取出测定 5min15s 时的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1,注意保证测定时间的准确性。

三、Lip 活力的计算

    A. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

    1. 按样本蛋白质浓度计算

酶活定义:37℃,pH4.5 条件下,每 mg 组织蛋白每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。Lip 活性(U/mg prot)= ΔA×V 反总÷(ɛ×d)×109÷(V 样×Cpr)÷T=215.05×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

酶活定义:37℃,pH4.5 条件下,每 g 组织每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。Lip 活性(U/g 质量)= ΔA×V 反总÷(ɛ×d)×109÷(V 样÷V 样总×W)÷T=215.05×ΔA÷W

3. 按细菌/细胞数量计算

酶活定义:37℃,pH4.5 条件下,每 104 细菌/细胞每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。Lip 活性(U/104 cell)= ΔA×V 反总÷(ɛ×d)×109÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T=215.05×ΔA÷细胞数量

4. 按照样本体积计算

酶活定义:37℃,pH4.5 条件下,每 mL 血清或液体样本每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需酶量为一个酶活单位。Lip 活性(U/mL)=ΔA×V 反总÷(ɛ×d)×109÷V 样÷T=215.05×ΔA

ε:藜芦醛摩尔消光系数:9300L/mol/cm;d:比色皿光径,0.6cm;V 反总:反应总体积,2×10-4L;V 样:加入样本体积,0.02mL,V 样总:提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5 min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

B. 96 UV 板测定的计算公式如下:

1. 按样本蛋白质浓度计算

酶活定义:37℃,pH4.5 条件下,每 mg 组织蛋白每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。Lip 活性(U/mg prot)= ΔA×V 反总÷(ɛ×d)×109÷(V 样×Cpr)÷T=358.42×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

酶活定义:37℃,pH4.5 条件下,每 g 组织每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。Lip 活性(U/g 质量)= ΔA×V 反总÷(ɛ×d)×109÷(V 样÷V 样总×W)÷T=358.42×ΔA÷W

3. 按细菌/细胞数量计算

酶活定义:37℃,pH4.5 条件下,每 104 细菌/细胞每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。Lip 活性(U/104 cell)= ΔA×V 反总÷(ɛ×d)×109÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T=358.42×ΔA÷细胞数量

4. 按照样本体积计算

酶活定义:37℃,pH4.5 条件下,每 mL 血清或液体样本每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需酶量为一个酶活单位。

Lip 活性(U/mL)=ΔA×V 反总÷(ɛ×d)×109÷V 样÷T=358.42×ΔA

ε:藜芦醛摩尔消光系数:9300L/mol/cm;d:比色皿光径,0.6cm;V 反总:反应总体积,2×10-4L;V 样:加入样本体积,0.02mL,V 样总:提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5 min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。


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