鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)活性检测试剂盒-鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-4459 规格:100T/96S 微量法
货号:UPLC-MS-4458 规格:50T/48S 紫外分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 110 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 40 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×2

4℃保存

试剂三

粉剂×2

4℃保存

试剂四

粉剂×1

-20℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前加 5 mL 试剂一,充分溶解;用不完的试剂 4℃保存;

2 试剂三:临用前加 5 mL 试剂一,充分溶解;用不完的试剂 4℃保存;

3 试剂四:每瓶临用前加 10 mL 试剂一,充分溶解,-20℃分装保存;-20℃保存一周。

产品说明:

鸟氨酸转氨酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸的关键酶之一,对植物适应逆境胁迫起重要作用。鸟氨酸和 α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和 NADH 的作用下,可发生酰基转移反应,生成 NAD 和吡咯醛-5-羧酸(P5C),NADH 340 nm 处有特殊吸收峰,通过检测在 340 nm 处吸光度的变化值,可计算出鸟氨酸转氨酶活性高低。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量石英比色皿/96 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1、组织样本:按质量(g):提取液体积(mL)1:5~10 比例(建议称取 0.1 g 样本,加入 1.0 mL 提取液) 加入提取液,冰浴匀浆后,于 4℃,12000 rpm,离心 10 min,取上清液置于冰上待测;

2、细胞样本:按细胞数量(104):提取液体积(mL)500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1.0 mL 提取液)加入提取液,冰浴超声破碎细胞(功率 300 W,超声 3 s,间隔 7 s,总时间 3 min);然后于 4℃,12000rpm,离心 10 min,取上清液置于冰上待测;

3、液体样本:直接测定。

二、测定步骤

1 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。

2 将配好的试剂二、三、四置于 37℃预热 10 min。(用多少,预热多少)

3 操作表:(在微量石英比色皿/96 UV 板中操作)

试剂名称(μL

测定管

空白管

试剂二

60

60

试剂三

60

60

试剂四

60

60

样本

20

-

蒸馏水

-

20

在微量石英比色皿/96 UV 板中分别加入上述试剂,充分混匀后于 340 nm 处测定 10 s 时的吸光值 A1,迅速置于 37℃水浴锅或培养箱 10 min(酶标仪有控温功能可将温度调至 37℃ 25℃),拿出迅速擦干测定 10 min10 s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。空白管只需做 1-2 次。注意:加入样本时开始计时。

三、δ-OAT 酶活含量的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(U/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×Cpr) ÷T=160.77×ΔA÷Cpr÷d

(2) 按样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(U/g 质量)= ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=160.77×ΔA÷W÷d

(3) 按样本细胞数量计算

酶活单位定义:每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

δ-OAT(U/104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T=160.77×ΔA÷细胞数量÷d

(4) 按样本液体体积计算

酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

δ -OAT(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷V 样÷T=160.77×ΔA÷d

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:微量石英比色皿光径,1 cm/96 UV 板光径,0.6 cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

注意事项:

1. ΔA 高于 0.5 时,建议将样本稀释后检测,并在计算公式中乘以稀释倍数。若 ΔA 过小时,可以加大样本量或者延长酶促反应时间。

2. 将试剂依次加入后应尽量快速混匀并测定 OD 值,减少误差时间。

3. ΔA 空白管一般不会超过 0.05。


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