货号:UPLC-MS-4341 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4340 | 规格:50T/48S |
紫外分光光度法 |
试剂名称
规格
保存条件
提取液
液体 110 mL×1 瓶
4℃保存
粉剂一
粉剂×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂×2 支
-20℃保存
试剂三
液体 3 mL×1 瓶
4℃保存
溶液的配制:
1、 提取液:临用前将粉剂一倒入提取液中,溶液为悬浊液,使用前需摇匀;
2、 试剂二:临用前取 1 支试剂二加入 1mL 蒸馏水,可以-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融。1 支即可做 100T, 为延长试剂盒使用时间,遂多给一支。
ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶,催化乙醇与乙醛可逆转换,在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成,肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。
ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+,NADH在340nm处有吸收峰,而NAD+没有;测定340nm 吸光度下降速率,来计算ADH活性。
需自备的仪器和用品:
冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可调式移液器、研钵/匀浆器、蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。16000g,4℃离心 20min,取上清置冰上待测。
2、 细菌、细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);16000g,4℃离心 20min,取上清液置冰上待测。
3、血清等液体:直接测定。
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到340nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一在25℃水浴中保温30min以上。
3、 空白管:在微量石英比色皿//96孔板(UV板)中依次加入20μL蒸馏水、8μL试剂二、152μL试剂一和20μL试剂三,迅速混匀后于340nm测定吸光值变化,分别记录15s和75s时吸光值,分别记为A1和A2。ΔA空白管=A1-A2。(空白管只需做1~2个)
4、 测定管:在微量石英比色皿//96孔板(UV板)中依次加入20μL上清液、8μL试剂二、152μL试剂一和20μL试剂三,迅速混匀后于340nm测定吸光值变化,分别记录15s和75s时吸光值,分别记为A3和A4。ΔA测定管=A3-A4。
活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。ADH (U/mg prot) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义:25℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。ADH (U/g 质量) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106] ÷(W×V样÷V样总)÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷W
(3) 按细胞数量计算
活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U /104 cell) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷细胞数量
(4) 按液体体积计算
活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/mL) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷V样÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4L; 106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1mL;T:反应时间,1min;细胞数量:以万计。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。ADH (U/mg prot) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义:25℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。ADH (U/g 质量) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(W×V样÷V样总)÷T=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷W
(3) 按细胞数量计算
活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/104 cell) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷细胞数量
(4) 按液体体积计算
活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。
ADH (U/mL) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷V样÷T=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管)
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4L; 106:单位换算系数,1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1mL;T:反应时间,1min;细胞数量:以万计。
上清液蛋白质浓度需要另外测定。
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