蔗糖合成酶(分解方向;SS-I)活性检测试剂盒-蔗糖合成酶(分解方向;SS-I)试剂盒-上海液质



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货号:UPLC-MS-4147 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-4146 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液

液体 30 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 8 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

-20℃保存

试剂三

液体 8 mL×1

4℃保存

标准品

粉剂×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前加入 2.5 mL 试剂一充分溶解待用,用不完的试剂建议分装后,-20℃保存,避免反复冻融;

2 标准品:20 mg 果糖,临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解,配成 20 mg/mL 果糖溶液备用,4℃保存一周。

产品说明:

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SS)是植物糖代谢过程的关键酶,负责催化蔗糖分解与合成的可逆反应,其分解活性可以催化蔗糖水解成 UDPG 与果糖, 参与淀粉、纤维素和半纤维素的合成等代谢途径。

分解方向 SS-I 催化蔗糖和 UDP 生成果糖与 UDPG,果糖与 3,5 -二硝基水杨酸反应生成在 540nm 有特征吸收峰的棕红色物质,通过测定 540nm 处吸光值变化可计算得 SS-I 活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

组织:按照质量(g):提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL 提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,8000g,离心 10min,取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。

2 20mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 5、4、3、2、1mg/mL 的标准溶液备用。

3 操作表 ( 1.5mL 离心管中操作) :

试剂名称(µL

对照管

测定管

标准管

空白管

样本

20

20

-

-

标准溶液

-

-

20

-


蒸馏水

-

-

-

20

试剂一

80

 

80

80

试剂二

-

80

-

-

混匀,30℃水浴 30 min 后,95℃水浴 10 min(盖紧,防止水分散失

 

试剂三

100

100

100

100

混匀,沸水浴 5 min(盖紧,防止水分散失,冷却至室温。

蒸馏水

800

800

800

800

混匀,置于 1mL 玻璃比色皿中,测定 540nm 处吸光值 A,分别记为 A 对照管,A 测定管,A 标准管,A 空白管。计算 ΔA=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。每个测定管需设一个对照管(标准曲线只需检测 1-2

三、SS-I活性计算

1 标准曲线的绘制:

以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(mg/mL)。

2 SS-I 活性的计算:

          (1) 按样本蛋白浓度计算

酶活定义:每 mg 蛋白每分钟分解蔗糖产生 1µg 果糖为 1 个酶活力单位。SS-I 酶活(U/mg prot)=x×V 提取÷(V 提取×Cpr)×103÷T = 33.33x÷Cpr

(2) 按样本质量计算

酶活定义:每 g 样本每分钟分解蔗糖产生 1µg 果糖为 1 个酶活力单位。SS-I 酶活(U/g 质量)=x×V 提取×103÷W÷T = 33.33x÷W

V 提取:提取液体积,1mL;103:单位换算系数,1mg=103µg;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间:30min。

注意事项:

1.  ΔA 超过 1 时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定,计算公式中乘以稀释倍数。

2. 95℃水浴时 EP 管盖紧,防止水分散失,待冷却至室温后(建议每次实验后冷却时间保持一致),再进行下一步操作,避免液体飞溅烫伤以及影响试验数据。


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