巯基检测

1. 样品及指标信息

样品：液体样本1份

指标：巯基

2. 实验方法简介

生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质，而且参与活性氧清除，后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和 GSH 含量，能够间接测定蛋白质巯基含量。

巯基基团与 5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在 412nm 处有*大吸收峰。

Sulfhydryl Group + 5, 5,- Dithiobis-2-Nitrobenoic acid 2-Nitro-5-Mercaptobenzoic Aicd (412nm)

3. 主要试剂

4. 仪器和设备

1. 可见分光光度计/酶标仪。

2. 水浴锅。

3. 可调式移液器。

4. 微量比色皿/96 孔板。

5. 试样制备

液体样本：直接测定。不浓度过高，可以用蒸馏水稀释上样，若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。

6. 分析步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 标准液的稀释：将25μmol/mL标准溶液用蒸馏水稀释至0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625μmol/mL的标准液，现用现配。

3. 操作表

试剂名称	对照管	测定管	标准管	空白管
样本（μL）	40	40	-	-
标准品（μL）	-	-	40	-
试剂一（μL）	150	150	150	150
试剂二（μL）	-	10	10	-
H₂O（μL）	10	-	-	50
混匀，室温准确静置10min，测定412nm吸光值，分别记为A对照、A测定、A标准、A空白，并计算ΔA 标准= A标准-A空白、ΔA测定= A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2 次。

7. 结果计算

1、标准曲线的绘制：根据标准管的浓度（y，µmol/mL）和吸光度ΔA标准（x，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（x，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（y，μmol/mL）。

2、总巯基含量计算：

（1）按样本质量计算：总巯基含量（μmol/g 质量）=y×V样总÷W=x÷W

（2）按样本蛋白浓度计算：总巯基含量（μmol/mg prot）=y×V样总÷（Cpr×V样总）=y÷Cpr

（3）按血清、培养液体积计算：总巯基含量（μmol/L）=y×V样÷（V样×10-3）=1000y

V样总：加入提取液体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.04mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度， mg/mL；10-3：单位换算系数，1mL=10-3L。

注意事项：

如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。注意同步修改计算公式。

8. 实验结果与分析

见附件（Excel表格）