货号:UPLC-MS-4209 | 规格:100T/96S |
微量法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液一 |
液体 110mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
提取液二 |
液体 110mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂一 |
液体 13mL×1 瓶 |
2-8℃保存 |
试剂二 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂四 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前取 1 支加入 1.1mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
2、 试剂三:临用前取 1 支加入 1.1mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
3、 试剂四:提供一 8mL 棕色空试剂瓶。临用前取 1 支试剂四加入 2.5mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,避免反复冻融。
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化,磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质,并在其中逐步转化为蔗糖。
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油醛,3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH,340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、天平、水浴锅、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、细胞超声破碎仪、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
1. 总 TPI 提取:按照组织质量(g)︰提取液一体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL 提取液一)进行冰浴匀浆,匀浆后冰浴超声波破碎(功率 200W,超声 3s,间隔 7s,总时间 1min),于 4℃,8000g 离心 10min,取上清,置于冰上待测。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,分光光度计蒸馏水调零。
2. 试剂一预热 15min 以上。
3. 测定管:依次取 120μL 试剂一、20μL 试剂二、20μL 试剂三、20μL 试剂四和 20μL 粗酶液于微量石英比色皿或 96 孔 UV 板,迅速吹打混匀,立即记录 340nm 处 20s 的吸光值 A1,迅速置于 37℃水浴锅或培养箱 5min(酶标仪有控温功能的可以将温度调至 37℃),拿出迅速擦干测定 5min20s 时的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
A、使用微量石英比色皿测定
1. 按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每 mg 组织蛋白每 min 生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。TPI 活性(U/mg prot)=(ΔA÷ε÷d)×V 反×109÷V 样÷Cpr÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义:每 g 组织每 min 生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。TPI 活性(U/g 质量)=(ΔA÷ε÷d)×V 反×109÷V 样×V 提÷W÷T×F=321.54×ΔA÷W×F
ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;109:单位换算系数,1mol=109nmol;V 反:反应总体积,2.0×10-4L;V 样:加入样本上清体积,0.02mL;V 提:加入提取液一或提取液二的体积,1mL;W: 样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,5min;F:稀释倍数。
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔UV板光径)进行计算即可。
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