细胞壁结合酸性转化酶(CWI)活性检测试剂盒-细胞壁结合酸性转化酶(CWI)试剂盒-上海液质



上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化elisa土壤植物细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测Elisa代测HPLC 检测GC检测GC-MS 检测LC-MS检测ICP-MS检测 、土壤植物动物成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购


货号:UPLC-MS-6036 规格:100T/48S 微量法
货号:UPLC-MS-6035 规格:50T/24S 可见分光光度法

产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称

规格

保存条件

提取液一

液体 30 mL×1

4℃保存

提取液二

液体 50 mL×1

4℃保存

试剂一

液体 60 mL×1

4℃保存

试剂二

粉剂×1

4℃保存

试剂三

液体 35 mL×1

4℃保存

标准品

粉剂×1

4℃保存

溶液的配制:

1 试剂二:临用前加入 25 mL 试剂一,充分溶解后待用;

2 标准品:10 mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水充分溶解,配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用,4℃保存一周。

产品说明:

蔗糖转化酶(Invertase,Inv)不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖,在植物蔗糖代谢中发挥着重要作用。Inv根据*适 pH,可分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI),其中 AI 根据亚细胞定位的差异又可分为可溶性酸性转化酶( Soluble acid Invertase SAI) 和细胞壁结合酸性转化酶( Cell wall-bound acid Invertase CWI)。CWI 以离子键的形式结合在细胞壁上,在“库”组织韧皮部蔗糖卸载、蔗糖质外运输、植物的生长发育以及抵抗各种胁迫中起着重要作用。

CWI 催化蔗糖降解产生还原糖,还原糖与 3,5 –二硝基水杨酸反应生成在 540nm 有特征吸收峰的棕红色物质, 通过测定 540nm 处吸光值变化可计算得 CWI 活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

组织:按照质量(g): 提取液一体积(mL) 1 : 5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL 提取液一)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,12000g,离心 10min,弃上清,留沉淀;沉淀中加入 1mL 蒸馏水,充分震荡混匀,4℃ 12000g,离心 10min,弃上清,留沉淀;沉淀中加入 1mL 提取液二,充分混匀,4℃浸提 15 h,4℃,12000g,离 10min,取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。

2 10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3mg/mL 的标准溶液备用。

3 操作表 ( 2mL 离心管中操作) :

试剂名称(µL

对照管

测定管

标准管

空白管

样本

200

200

-

-

标准溶液

-

-

200

-

蒸馏水

-

-

-

200

试剂一

800

 

800

800

试剂二

-

800

-

-

混匀,37℃水浴 30min 后,95℃水浴 10 min盖紧, 防止水分散失)。

 

试剂三

500

500

500

500

混匀,95℃水浴 5 min(盖紧,防止水分散失),冷却至室温。

混匀,取 1000 µL 置于 1 mL 玻璃比色皿中,测定 540nm 处吸光值A,分别记为 A 对照管,A测定管,A 标准管,A 空白管。计算 ΔA=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。每个测定管需设一个对照管(标准曲线只需检测 1-2 )

注意:如果样本在 37℃反应后的 95℃水浴步骤中出现沉淀,建议室温 12000g,离心 5min,取上清(若上清不足 1000µL,可按比例缩小加样体系,如 800µL 上清+400µL 试剂三)进行下一步操作。

三、CWI活性计算

1 标准曲线的绘制:

以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将 ΔA 带入方程得到 x(mg/mL)。

2 CWI 活性的计算:

         (1) 按样本蛋白浓度计算

酶活定义:37℃ mg 蛋白每分钟分解蔗糖产生 1µg 还原糖为 1 个酶活力单位。CWI 酶活(U/mg prot)= x×V 提取÷(V 提取×Cpr)×103÷T = 33.33x÷Cpr

(2) 按样本质量计算

酶活定义:37℃ g 样本每分钟分解蔗糖产生 1µg 还原糖为 1 个酶活力单位。CWI 酶活(U/g 质量)= x×V 提取×103÷W÷T = 33.33x÷W

V 提取:提取液体积,1mL;103:单位换算系数,1mg=103µg;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间,30min。

注意事项:

1.  ΔA 超过 1 时,建议将样本用提取液二稀释后再进行测定,计算公式中乘以稀释倍数。

2.95℃水浴时 EP 管盖紧,防止水分散失,待冷却至室温后(建议每次实验后冷却时间保持一致),再进行下一步操作,避免液体飞溅烫伤以及影响试验数据。


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