上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测,Elisa代测,HPLC 检测,GC检测,GC-MS 检测,LC-MS检测,ICP-MS检测 、土壤、植物、动物,成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
货号:UPLC-MS-4335 | 规格:100T/96S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4334 | 规格:50T/48S |
紫外分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 100 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 15 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
试剂三 |
粉剂×2 支 |
-20℃保存 |
试剂四 |
粉剂×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂五 |
粉剂×1 支 |
-20℃保存 |
试剂六 |
液体 48 μL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂七 |
液体 55 μL×1 瓶 |
-20℃保存 |
试剂八 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂九 |
粉剂×1 支 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1、 提取液:临用前将试剂九加入到提取液中,并于 4℃保存;
2、 试剂二:临用前每瓶加入 1 mL 双蒸水,充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存;
3、 试剂三:临用前每瓶加入 1 mL 双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂-20℃保存;
4、 试剂四:临用前每瓶加入 2 mL 双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂-20℃保存;
5、 试剂五:临用前每支加入 0.5 mL 双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂-20℃保存;
6、 试剂六:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂六、蒸馏水按 43:457(V:V)的比例配制备用,现用现配;
7、 试剂七:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂七、蒸馏水按 1:9(V:V)的比例配制备用, 现用现配;
8、 试剂八:临用前加入 5 mL 双蒸水,充分溶解待用。用不完的试剂仍 4℃保存;
9、 工作液:吸取 0.06 mL 试剂二、0.2 mL 试剂三、0.13 mL 试剂四、0.04 mL 试剂五、0.04 mL 试剂六、0.04 mL 试剂七、0.2 mL 试剂八混匀,也可根据比例现用现配,于冰上备用。
ACK广泛存在于生物体内,催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP,是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶,尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。
测定原理如下:(1)ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP,(2)丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP 和丙酮酸,(3)乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,(4)在340nm下测定NADH氧化生成NAD+速率,即可反映ACK活性。
需自备的仪器和用品:
台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或细胞处理:
收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测。
2、组织处理:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测。3、血清(浆):直接检测。
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)保温15min。
3、 操作表:
试剂名称 |
测定管 |
空白管 |
蒸馏水(μL) |
- |
20 |
试剂一(μL) |
110 |
110 |
工作液(μL) |
70 |
70 |
样本(μL) |
20 |
- |
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/石英 96 孔板中,加样本的同时开始计时,在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1,准确反应 3 分钟立刻 340 nm 下比色,记录 3 分 20 秒时的吸光度A2,计算 ΔA 测定=A 测定 1-A测定 2,ΔA 空白=A 空白 1-A 空白 2,计算 ΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T=536×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算:
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×W) ÷T=536×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×500) ÷T=1.072×ΔA
4. 按血清体积计算:
单位的定义:每mL血清(浆)中消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ACK(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=536×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样: 加入样本体积,0.02mL;V提取:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W: 样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
B. 用96孔板测定:
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算。
1、 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失活。
2、 反应液的温度必须保持37℃或25℃,比色皿测定时可取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、 ΔA大于1时,建议稀释后测量,注意计算公式乘以稀释倍数;ΔA小于0.01时,建议延长反应时间测量,注意计算公式变化。
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