上海液质是一家拥有12000多种高端成熟型生化、elisa、土壤、植物、细胞等试剂盒的生产厂家,并承接生化代测,Elisa代测,HPLC 检测,GC检测,GC-MS 检测,LC-MS检测,ICP-MS检测 、土壤、植物、动物,成分酶活检测等科研检测服务。如有需要立即询购
货号:UPLC-MS-4403 | 规格:100T/48S | 微量法 |
货号:UPLC-MS-4402 | 规格:50T/24S |
可见分光光度法 |
试剂名称 |
规格 |
保存条件 |
提取液 |
液体 70 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂一 |
液体 30 mL×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂二 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂三 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
试剂四 |
粉剂×1 瓶 |
4℃保存 |
溶液的配制:
1. 试剂二:临用前加入 5.2 mL 试剂一充分震荡溶解;
2. 试剂三:临用前加入 2.6 mL 试剂一充分震荡溶解;
3. 试剂四:临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解,备用。
AchE 属于丝氨酸水解酶,广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE 催化乙酰胆碱(Ach)水解,在神经传导调节中起重要作用。
AchE 催化 Ach 水解生成胆碱,胆碱与二硫对硝基苯甲酸(DTNB)作用生成 5-巯基-硝基苯甲酸(TNB);TNB在 412nm 处有吸收峰,通过测定 412nm 吸光度增加速率,计算 AchE 活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液) 进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心 10min,取上清液待测。
2. 细菌、细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
样本 |
15 |
15 |
试剂二 |
50 |
- |
37℃ 水浴准确反应5min。 |
||
试剂四 |
50 |
50 |
试剂二 |
- |
50 |
混匀后12000rpm常温离心5min。分别吸取10μL上清液于新的EP管或96孔板中,之后分别加入。 |
||
试剂一 |
170 |
170 |
试剂三 |
20 |
20 |
混匀,放置2min后于微量玻璃比色皿中或96孔板中测定412nm处的吸光度,记为A测定管,A对照管,计算ΔA=A测定管-A对照管。 |
A、用微量玻璃比色皿测定计算公式:
1. 组织 AchE 活性
(1) 按照蛋白浓度计算
活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 为 1 个酶活单位。
AchE 酶活(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V 显色×109] ÷(Cpr ×V 样×V 上清÷V 酶促)÷T=2255×ΔA ÷Cpr。
(2) 按照样本质量计算
活性单位定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 为 1 个酶活单位。
AchE 酶活(U/g 质量)=[ΔA÷(ε×d)×V 显色×109]÷(W ×V 样÷V 样总×V 上清÷V 酶促)÷T =2255×ΔA÷W。
2. 细菌、细胞 AchE 活性
活性单位定义:每 104 个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 为 1 个酶活单位。
AchE 酶活(U/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V 显色×109]÷(细胞数量×V 样÷V 样总×V 上清÷V 酶促)÷T=2255×ΔA÷细胞数量
3. 血清 AchE 活性
活性单位定义:每毫升血清每分钟催化产生 1nmol TNB 为 1 个酶活单位。
AchE 酶活(U/mL)= [ΔA÷(ε×d)×V 显色×109]÷(V 样×V 上清÷V 酶促)÷T =2255×ΔA
ε:TNB 摩尔消光系数,13.6×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 显色:显色反应体系总体积(L), 0.2mL=2×10-4L;109:单位换算系数,1mol=1×109nmol;V 酶促:酶促反应总体积,0.115mL;V 上清:吸取上清液体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V 样:加入样本体积(mL),0.015mL;T:反应时间(min),5min;细胞数量:提取时的细胞数量,万个。
将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm 进行计算即可。
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